Е. А. Евстигнееев родился 9 октября 1926 года в Нижнем Новгороде.
Детство Евгения прошло на окраине, которая называлась посёлком Володарского. Его отец был на двадцать лет старше матери. Оба они были рабочими: Александр Михайлович — металлист, Мария Ивановна — фрезеровщица. Для своей матери — Марии Ивановны — он был поздним ребёнком: когда он появился на свет, ей было 32 года. Женя рано, шести лет, остался без отца, мама второй раз вышла замуж, но и отчим умер, когда мальчику было семнадцать. До войны Женя успел окончить семилетку и в сорок первом пошёл работать электромонтёром. Потом год проучился в дизелестроительном техникуме, но после смерти отчима пришлось идти зарабатывать. Четыре года он слесарил на заводе «Красная Этна», занимался в самодеятельности, играл джаз. Евгений Александрович был очень музыкален, виртуозно играл на разных инструментах: на гитаре, на рояле и даже на вилках. Выступал в разных местах. Однажды в 1946 году в кинотеатр, где в составе джаз-оркестра Евгений играл ударником, пришёл директор Горьковского театрального училища Виталий Лебский. Директор от одного актёра узнал, что там необыкновенный ударник, и решил посмотреть. Парень действительно был странный. Он играл так виртуозно и самозабвенно, вытворял с барабанными палочками нечто невообразимое, заслоняя собой целый оркестр и приводя публику в восторг. От него нельзя было оторваться.
После того как оркестранты отыграли очередную композицию, Виталий Лебский подошёл к музыканту и спросил его: «Молодой человек, не хотите ли вы стать драматическим актёром?» На что Евстигнеев простодушно ответил: «Я не знаю». — «Тогда вот вам мои координаты, и я жду вас у себя», — продолжил Лебский и вручил парню бумажку с адресом училища.
В 1946 году Евгений был зачислен на первый курс Горьковского театрального училища. Окончив театральное училище в 1951 году, Евстигнеев был распределен во Владимирский областной драматический театр имени А. Луначарского.
В 1954 году поступил в Школу-студию МХАТ, причём сразу на второй курс.
В середине 1955 года студенты Школы-студии МХАТ создали «Студию молодых актёров», которая через год стала базой для нового столичного театра — «Современник».
В 1956 году окончил Школу-студию МХАТ (курс П. В. Массальского).
Первую свою значительную роль в «Современнике» Евстигнеев сыграл в 1960 году в спектакле «Голый король» по пьесе Е. Шварца. После этого спектакля исполнитель главной роли — короля — Евстигнеев проснулся знаменитым.
Настоящая всесоюзная слава пришла к Евстигнееву в 1964 году — после роли Дынина в фильме режиссёра Э. Г. Климова «Добро пожаловать, или Посторонним вход воспрещен».
Последней ролью Евстигнеева в «Современнике» был Дорн в «Чайке»» А. П. Чехова в 1970 году.
В 1971 году вслед за О. Н. Ефремовым, перешёл в труппу МХАТа. Первой его ролью на новой сцене стал Володя в спектакле «Валентин и Валентина» по пьесе М. М. Рощина. В декабре 1980 года у Евстигнеева случился инфаркт. На рубеже 90-х годов он сыграл в Театре Антона Чехова Фирса в «Вишнёвом саде», в 1991 году — в АРТели АРТИСТОВ С. Ю. Юрского — Глова в спектакле «Игроки-XXI». Последней ролью Евстигнеева в кино был царь Иван Грозный в фильме В. Ускова и В. Краснопольского «Ермак».
В 1988 году году сыграл профессора Преображенского в фильме Собачье сердце.
Е. А. Евстигнеев умер перед операцией на сердце в Лондоне 4 марта 1992 года.
Похоронен в Москве на Новодевичьем кладбище (участок № 10).